RNA/DNA比值测定
1.所需药品及方法：
1、0.6mol/L HClO4 溶液配制，市售HClO4 48.94mL溶于适量超纯水中，定容至1000mL
0.2mol/L HClO4 溶液配制，市售HClO4 16.31mL溶于适量超纯水中，定容至1000mL
2、0.05 mol/L pH=7.4 Tris-HCl 缓冲液配制，500mL 0.1mol/L Tris溶液+420.0mL HCl溶液混合，超纯水定容至1000 mL。
3、0.3mol/L KOH 溶液配制，16.8g KOH固体溶于适量超纯水，冷却后定容至1000mL。
[测定方法]
1、把适量肌肉与缓冲液(0.05mol Tris_HCl,pH=7.4)混合匀浆,取1.4 mL匀浆液和0.7mL冷的HClO4（0.6mol/L）混合,于冰上冷却15 min后,在4℃下离心(10000r/min)10 min,去掉上清液；
2、将沉淀用1.12mL KOH（0.3mol/L）的在37℃水浴1h后冰浴30 min,离心(方法同上)。取其上清液,于751G型分光光度计(上海分析仪器厂)上读取260 nm处的吸光值,此为RNA在260 nm处的吸光值；
3、将沉淀用2.0mL冷的HClO4（0.2 mol/L）洗涤,离心,去掉上清液。在沉淀中加入2.2mL HClO4（0.6 mol/L）于85℃水浴中15 min后,再冰浴15 min,离心,取其上清液,在260nm处测吸光值,此为DNA在260nm处的吸光值。从而估测RNA/DNA的比值。
蛋白酶活力测定
1.所需药品及方法
1、福林试剂，待购。
2、0.55mol/L Na2CO3溶液，58.3g Na2CO3超纯水溶解，定容至1000 mL。
3、10%三氯乙酸（质量分数）。
4、0.02 mol/L pH7.5磷酸缓冲液：
0.02M 磷酸氢二钠溶液的配制：取Na2HPO4·2H2O 3.561g (或Na2HPO412H2O 7.164g)，溶解于1L蒸馏水中。0.02M 磷酸二氢钠溶液的配制：取NaH2PO4 H2O 2.76g (或NaH2PO4 2H2O 3.121g)，溶解于1L蒸馏水中。
将0.02mol/L磷酸氢二钠溶液84mL与0.02mol/L磷酸二氢钠溶液16mL混合，即为0.02mol/L pH7.5磷酸缓冲液。
5、0.5％酪素：（酪蛋白）0.5克，以0.5 mol/L NaOH 1mL湿润。再加少量0.02M pH7.5磷酸缓冲液稀释。在热水浴中溶解，定容至100mL，冰箱中可保存一周。100mL。
[材料及实验器材]：
分光光度计、光径1.0cm比色杯、离心管、电子天平、离心机、匀浆器、剪子、镊子、冰块、试管若干、移液管若干。
[实验步骤]
1、酶粗提液的制备
取新鲜肝胰脏、胃、肠组织称重，在冰盘上剔除脂肪及内容物，以10倍缓冲液或去离子水匀浆各组织，将组织悬液低温下离心（3000rpm/min）,上清液为酶粗提液（酶液）。
2、酶活力测定
（1）标准曲线的制作：精确称取烘干的酪氨酸50mg，加少量0.2N盐酸溶解，定容至100mL，分别配制溶液0—100μg/mL不同浓度溶液，不同浓度各取酪氨酸溶液1mL，加0.5％酪素2mL，于37℃ 水浴中反应15分钟，然后加入三氯乙酸3mL，离心除去沉淀。取清液1mL，加入0.55mol/L碳酸钠5mL，再加入福林试剂1mL，于37℃水浴显色15分钟，在680nm波长下比色，测光密度（OD值）。以光密度读数为纵坐标，酪氨酸的微克数为横坐标，绘制曲线。
（2）样品测定
样品测定设对照管和测定管。
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对照管 测定管 |
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适当稀释酶溶液 / 0.5mL 去离子水 0.5mL / |
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37℃水浴预热3---5分钟 |
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0.5%酪素（预热过） 1mL 1mL |
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37℃水浴准确反应15分钟 |
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10％三氯乙酸 1.5mL 1.5mL |
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离心去除沉淀 |
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取上清液于另外试管内 0.5mL , ; 0.5mL |
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0.55mol/L碳酸钠 2.5mL 2.5mL |
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福林试剂 0.5mL 0.5mL |
37℃水浴显色15分钟，680nm波长比色，以对照管校零，读取测定管光密度。
3、计算
在37℃下每分钟水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位
蛋白酶的活力单位＝A/15×F
A为样品测得光密度查曲线，得相应酪氨酸μg数
F 为酶液最终稀释倍数，15为反应时间（min）
[方法评估]
福林—酚法测定蛋白酶活力是生产实践和科学研究中应用的基本实验方法。
[应用意义]
水产动物消化系统内的消化酶随动物种类而异，而且消化酶的种类和在消化道中分布的差别是和动物食性相适应的。分析消化蛋白酶活力有助于了解动物对蛋白质食物的消化能力，掌握动物的营养需求。
[注意事项]
1、实验材料应新鲜，不新鲜会发生组织自溶和酶原被破坏。
2、酶液与底物作用时间、作用温度要严格控制，否则数据误差很大。
3、酶液要用适当缓冲液稀释到测定光密度在0.2—0.6之间。
淀粉酶活力的测定
[目的与原理]
掌握淀粉酶活力的测定方法，测定水产经济动物主要笑话器官的肝胰脏、胃、肠内的淀粉酶活力。
淀粉酶催化淀粉扥子中葡萄糖苷键水解，产生葡萄糖、麦芽糖等。在基质充分的条件下，反应后加入的碘液与未被水解的淀粉结合成蓝色的复合物，其蓝色深浅与未经酶促反应的空白管比较吸光度，从而推算出淀粉酶的活力单位。
[试剂与器材]
1、0.2%可溶性淀粉
精确称取可溶性淀粉1.00g ，置于20mL烧杯内，加入蒸馏水25mL，摇匀使成为淀粉混悬液；称取无水磷酸二氢钠13.3g及苯甲酸4.3g，共置于500mL烧杯内，加入蒸馏水越250mL，煮沸后，将淀粉混悬液倒入此杯内，并用蒸馏水洗涤装混悬液的烧杯数次，洗涤液亦倒入此烧杯内，继续煮沸1分钟，冷却至室温后倒入500mL容量瓶中，并用蒸馏水稀释至500mL刻度。此淀粉pH应为7.0±0.1，在室温下课保存2~3个月。
2、0.1mol/L 碘贮存液：精确称取碘酸钾（KIO3）0.3567g及碘化钾（KI）4。5g置于100mL容量瓶内，加入蒸馏水80mL，然后缓慢加入浓盐酸0.9mL，摇匀后用蒸馏水稀释至100mL刻度，置于冰箱内备用。
3、0.01mol/L碘应用液：取上述碘贮存液50mL，用蒸馏水稀释至500mL,盛于棕色瓶中置于冰箱内，可保存1个月。
[实验材料及器材]
所采集样品。分光光度计、电子天平、离心机、pH测定仪、恒温水箱、匀浆器、剪子、镊子、冰块、50mL比色管若干、移液管若干，500mL容量瓶，烧瓶。
[实验步骤]
1、酶提取液的制备（同蛋白酶）
2、淀粉酶活力的测定
取50mL刻度比色管二只，表明为对照管，测定管。
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对照管 |
测定管 |
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2%可溶性淀粉 |
1.0ml |
1.0ml |
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将两管在37℃水浴中预热2-5分钟 | ||
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酶液 |
— |
0.02mL |
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测定管混匀后，再置于37℃水浴中反应7.5分钟 | ||
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0.01mol/L碘应用液 |
1.0mL |
1.0mL |
用蒸馏水稀释至10mL，立即混匀。用660nm或红色滤光板进行比色，以蒸馏水校正光密度0点，读取对照管和测定管光密度读数。
3、计算
淀粉酶活力单位定义：在37℃、30min内，100mL酶液中的淀粉酶能够完全水解淀粉10mg称为一个淀粉酶活力单位。
淀粉酶活力单位/100mL=（对照管光密度—测定管光密度）/对照管光密度×2/10×30/7.5×100/0.1=（对照管光密度—测定管光密度）/对照管光密度×800
[方法评估]
测定淀粉酶的方法有很多种，大致可以分为两类：即测定底物（淀粉）的减少量和测定产物（如还原性糖）的生成量。本实验采用前者的淀粉—碘比色法。
[注意事项]
1、0.04%可溶性淀粉溶液5mL内淀粉含量为2mg，在本法条件下，当2mg淀粉完全水解时相当于800淀粉酶单位/100mL（即：2/10×30/7.5×100/0.1=800）。
2、对照管内含淀粉2mg，由于淀粉溶液比较稳定，故对照管在固定比色计上的光密度读书并不改变，因而在测定中不必每次作对照管。
3、当酶液接近800单位时，由于淀粉已几乎完全被水解，故加入碘液后也不再显蓝色，因此淀粉酶单位较高时（接近600单位）宜将标本稀释（2~5倍）后重新测定，并将测定结果乘以稀释倍数。
4、如淀粉溶液出现大量浑浊或者絮状物，表示淀粉溶液污染或者变质，不能再使用。
5、唾液内含有大量的淀粉酶，故即使是唾液的飞沫污染，也能使测定结果显著偏高。
脂肪酶活力的测定
[目的与原理]
掌握脂肪酶活力的测定方法，并测定鱼、虾、贝体内消化器官肝胰脏、胃、肠的脂肪酶活力。
脂肪酶在一定条件下，将甘油三酯水解。在不同水解阶段可分别产生脂肪酸、甘油二酯、甘油一酯及甘油。水解所产生的脂肪酸可以用标准的氢氧化钠滴定，用滴定值表示酶活力。
[试剂与器材]
试剂：
1、聚乙烯醇(P. V. P.)橄榄油乳化液：称取40克聚乙烯醇，加蒸馏水约1000mL，在小火上加热，并不停搅拌，至聚乙烯醇全部溶解，冷却后定容至1000毫升。用双层纱布过滤，滤液备用；取4％聚乙烯醇溶液300毫升，加100毫升橄榄油，用高速组织捣碎机搅动6分钟，即成乳白色聚乙烯醇橄榄油乳化液，保存于低温下（4℃）备用。 400
2、0.025mol/L磷酸缓冲液（pH7.5）
0.025mol/L磷酸氢二钠溶液的配制：取Na2HPO4·2H2O 4.45g溶于1L蒸馏水中；
0.025mol/L磷酸二氢钠溶液的配制：取NaH2PO4·H2O 3.45g（或NaH2PO4·2H2O 3.90g）溶于1L蒸馏水中。
将0.025mol/L磷酸氢二钠84mL与0.025mol/L磷酸二氢钠16mL混合，即为0.025mol/L磷酸缓冲液。 500
3、0.05mol/L氢氧化钠标准溶液 0.5 1000
4、1％酚酞指示剂：取1g酚酞溶于100mL 70％乙醇溶剂中。 100
5、95％乙醇 1000
[实验材料与器材]
鱼、虾、贝的肝胰脏、胃、肠标本。
匀浆器、离心机、恒温水浴。高速组织捣碎机、酸式滴定管、滴定管架、镊子、剪子、锥形瓶、移液管、烧杯。
[实验步骤]
1、酶粗提液的制备（见蛋白酶活力的测定）。
2、取100mL锥形瓶3个，一个作为对照组，另两个为测定组
0.025M磷酸缓冲液（pH7.5） 5mL 5mL 5mL
聚乙醇橄榄油乳化液 4mL 4mL 4mL
用0.05mol/L标准氢氧化钠滴定至微红色，记录滴定消耗的NaOH体积（mL)数。
计算：
酶活力以国际单位表示，即在一定条件下，脂肪酶水解脂肪每分钟产生1微克分子脂肪酸的酶量定为一个国际单位。
脂肪酶活力单位＝（A－B）N·f
t
式中： A为样品耗碱液mL数， B为对照组耗碱液mL数
N为每毫升碱液微克分子数，f为稀释倍数
t为作用时间 (分)
[应用意义]
脂肪酶是动物消化脂肪的重要酶类其分泌量和活力与动物对脂肪的消化、吸收、利用有关。水产动物肝胰脏或胰脏是脂肪酶的主要分泌器官，胃肠粘膜及肝脏亦能分泌，有的鱼类幽门垂中脂肪酶活力最高。测定水产动物各部位脂肪酶活力有助于研究、分析其对脂肪的消化能力及各部位消化功能状况。