SB/T 10317-1999 蛋白酶活力测定法

     本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。
SB/T 10317-1999
1   福林法
  1.1   试剂及溶液:  以下试剂都为分析纯
  1.1.1   福林试剂(Folin试剂):于 2000mL 磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)
100g,钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,蒸馏水 700mL,85%磷酸 50mL,浓盐酸 100mL,文火回流
10h。
取去冷凝器,加入硫酸锂(Li2SO4)50g,蒸馏水 50mL,混匀,加入几滴液体溴,再煮沸 15min,
以驱逐残溴及除去颜色,溶液应呈黄色而非绿色。若溶液仍有绿色,需要再加几滴溴液,再
煮沸除去之。冷却后,定容至 1000mL,用细菌漏斗(No4～5)过滤,置于棕色瓶中保存。此溶
液使用时加 2 倍蒸馏水稀释。即成已稀释的福林试剂。
  1.1.2  0.4mol 碳酸钠溶液:  称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g,定容至 1000mL。
  1.1.3  0.4mol三氯乙酸(T C A)溶液:  称取三氯乙酸(CCL3COOH)65.4g,定容至 1000mL。  
  1.1.4  pH7.2 磷酸盐缓冲液:称取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)31.2g,定容至 1000mL,即
成 0.2mol 溶液(A液)。称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)71.63g,定容至 1000mL,即成
0.2mol 溶液(B 液)。
     取A  液28mL  和B 液72mL,再用蒸馏水稀释1倍,即成0.1mol pH7.2的磷酸盐缓冲液。    1.1.5  2%酪蛋白溶液:准确称取干酪素 2g,称准至 0.002g,加入 0.1N氢氧化钠 10mL,在
水浴中加热使溶解(必要时用小火加热煮沸),然后用 pH7.2 磷酸盐缓冲液定容至 100mL 即
成。配制后应及时使用或放入冰箱内保存,否则极易繁殖细菌,引起变质。
  1.1.6  100μg/mL 酪氨酸溶液:精确称取在 105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸 0.1000g,逐
步加入 6mL 1N 盐酸使溶解,用 0.2N 盐酸定容至 100mL,其浓度为 1000μg/mL,再吸取此液
10
mL,以 0.2N 盐酸定容至 100mL,即配成 100μg/mL 的酪氨酸溶液。此溶液配成后也应及时
使
用或放入冰箱内保存,以免繁殖细菌而变质。
  1.2   仪器
    a.   分析天平:  感量 0.1mg;
    b.  581-G 型光电比色计或 72 型分光光度计;
    c.   水浴锅;
    d.  1、2、5、10mL 移液管等。
  1.3   操作
  1.3.1   标准曲线的绘制
  1.3.1.1   按下表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液(表 1)。
                    表 1   配制各种不同浓度的酪氨酸溶液
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