DB33 T 555 2005 植物源食品中甲醛残留量的测定 高效液相色谱法

植物源食品中甲醛残留量的测定高效液相色谱法
Determination of formaldehyde in vegetable Food-
High-performance liquid chromatography

1　范围

本标准规定了用高效液相色谱法测定植物源性食品中甲醛残留量的方法。

本标准适用于植物源性食品中甲醛残留量的测定。

本标准检出限和定量测定范围：本方法最小检出量为5×10^-11g，若称取5g试样，萃取后定容至5mL，进样量为10μL，本标准的最低检出质量浓度为0.05mg／kg。

衍生物经石油醚提取净化后，可以消除干扰而直接测定试液中的甲醛残留量。

警告——使用本标准的人员应有正规实验工作的实践经验．本标准并未指出所有的安全问题．使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件．

2　规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

GB/T 5009.1  食品卫生检验方法  理化部分  总则

GB/T 6682  分析实验室用水规格和试验方法

3　原理

试样经60℃水浴萃取，从食品中萃取的甲醛被水吸收，萃取液在酸性条件下，与2，4－二硝基苯肼于室温避光下过夜进行衍生化。衍生物经提取净化后，进高效液相色谱仪，经反相色谱分离后，根据保留时间和峰面积进行定性和定量。

4　试剂

4.1　除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂，水为GB/T 6682二级。

4.2　甲醇:色谱纯。

4.3　石油醚：沸程60℃～90℃，重蒸馏。

4.4　盐酸（HCl）, ρ＝1.19g/mL。

4.5　冰乙酸（CH3COOH），ρ＝1.05g/mL。

4.6　盐酸溶液（2mol/L）：量取84mL盐酸（4.4），加水稀释至500mL。

4.7　乙酸溶液（1＋1）：量取250mL冰乙酸（4.5），加水稀释至500mL。

4.8　乙酸锌溶液[Zn（CH3COO）2·2H2O]（219.0g/L）：称取21.90g乙酸锌，加3mL冰乙酸（4.5），加水溶解并稀释至100mL。

4.9　2，4－二硝基苯肼溶液（C6H6N4O4）（2.5g/L）：称取0.25g 2，4－二硝基苯肼于100mL容量瓶中，加少量甲醇和少量盐酸（4.4）溶解，加盐酸溶液（4.6）定容至刻度。将配好的2，4－二硝基苯肼溶液置于250mL分液漏斗中，加石油醚100mL剧烈振摇，静置，弃去石油醚层，重复操作一次。

4.10　乙酸铵溶液（CH3COONH4）（0.01mol/L）：称取0.77g乙酸铵，加水950mL水使溶解，用乙酸溶液（4.7）调节pH 为4.0后，加水至1000mL，过0.45μm滤膜。

4.11　甲醛标准溶液（100mg/L），国家标准物质。

4.12　甲醛标准使用液（2.5 mg/L）：临用前将甲醛标准溶液（4.11）用水经逐级稀释配制。

4.13　无水硫酸钠（Na2SO4）：650℃灼烧4h，在干燥器内冷却至室温，贮于密封瓶中备用。

5　仪器

5.1　高效液相色谱仪（附紫外检测器）

5.2　旋转蒸发仪

5.3　离心机

5.4　无水硫酸钠柱：60mm×20mm短标漏斗，底部垫5mm高脱脂棉，再装50mm高无水硫酸钠。

6　取样

6.1　采样步骤

为制备实验室样品的采样过程应按GB/T 5009.1的规定的方法进行。

6.2　试样的制备

    将采集的样品去除其中杂物，取可食部分。混匀后用四分法缩分至约50g，经粉碎混匀后贮于玻璃瓶中备用。

7　分析步骤

7.1　样品处理

7.1.1　提取

7.1.1.1　对一般植物源性食品样品：称取5g粉碎的均匀试样（精确到0.01g）于100mL具塞刻度试管中，加水30mL，混匀并定容至50mL。塞紧塞子，于60℃水浴中加热40min，取出后于冰水浴中快速冷却。然后于3 000r/min离心5min，取上清液。

7.1.1.2　对食用菌类样品：称取5g粉碎的均匀试样（精确到0.01g）于100mL具塞刻度试管中，加入约25mL水，慢慢加入10mL乙酸锌（4.8）溶液，混匀并定容至50mL，静置30min。塞紧塞子，于60℃水浴中加热40min，取出后于冰水浴中快速冷却。然后于3 000r/min离心5min，取上清液。

7.1.2　衍生化

7.1.2.1　样品衍生

移取25.0mL上清液于50mL试管中，加入2.5mL2，4－二硝基苯肼，于暗处室温下静置过夜。移衍生液于分液漏斗中，加50mL石油醚剧烈振摇，静置，将石油醚层过无水硫酸钠柱至平底烧瓶，水层中再加入50mL石油醚，重复上述操作一次，合并石油醚层，于旋转蒸发仪上55℃以下减压蒸干，用甲醇溶解残渣并定容至5mL，经滤膜（0.45μm）过滤后待测。同时做空白试验。

7.1.2.2　标准溶液的衍生

准确移取甲醛标准使用液（4.12）5.00mL于50mL试管中，加水20.0mL，按7.1.2规定的步骤进行衍生。该溶液相当于甲醛浓度为2.5mg/L。

7.2　测定

7.2.1　测定色谱条件

7.2.1.1　色谱柱：反相C18不锈钢柱，125 mm×4.0mm, 5μm。

7.2.1.2　检测波长：365nm。

7.2.1.3　流动相：甲醇＋0.01mol/L乙酸铵溶液（70＋30）。

7.2.1.4　柱温：室温。

7.2.1.5　流速：0.5mL/min。

7.2.1.6　进样量：10μL。

7.2.2　样品测定

按仪器条件，对标准工作液和样液等体积交替进样，根据保留时间定性，外标法定量。

8　结果计算

样品中甲醛含量以质量分数W计，数值以毫克每千克（mg/kg）表示，按下列公式计算：

式中：

C——试样衍生液中甲醛质量浓度，单位为毫克每升（mg/L）；

C₀——空白试验溶液中甲醛质量浓度，单位为毫克每升（mg/L）；

V——试样衍生液的定容体积，单位为毫升（mL）；

V₁——衍生用提取液的体积，单位为毫升（mL）；

V₂——样品提取液的体积，单位为毫升（mL）；

m——试样的质量的数值，单位为克（g）。

计算结果表示到二位有效数字。样品含量超10mg/kg时表示到三位有效数字。

9　精密度

对于甲醛含量在大于1.0 mg/kg、0.1 mg/kg～1.0 mg/kg范围，在重复性条件下获得的两次独立测试结果的相对相差应分别不大于10%和20%。

图1.甲醛－二硝基苯腙的色谱图                                 图2.空白米粉干标准添加色谱图